г. Севастополь +7 (978) 108-02-17 info@biofotonika-center.ru
Главная » Новости » Статьи » Научное исследование препарата "НЕОКОЛЛ+"

Научное исследование препарата «НЕОКОЛЛ+»

Исследование безопасности и эффективности геля для внутрикожных инъекций  «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017

Научное исследование выполнено по заказу ООО «Русские Технологии Красоты».

НИР выполнена на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора


Испытания токсичности

Испытание на аномальную токсичность проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I (ОФС.1.2.4.0004.15). Испытание проводили на двух видах животных: белых мышах массой (18-20) г и морских свинках массой (250-300) г. Исходную массу животных определяли и регистрировали в день начала испытаний. В исследованиях были использованы здоровые животные, содержащиеся на регламентированном пищевом рационе, которые ранее не использовались для проведения каких-либо испытаний.

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017 , экспериментальная серия.

Препарат вводили подкожно по 1,0 мл двум морским свинкам и внутрибрюшинно по 1,0 мл пяти белым мышам со скоростью 0,1 мл/сек.

Наблюдение за животными осуществляли ежедневно в течение 7 дней с регистрацией всех изменений в состоянии здоровья каждого животного. Через 1 сутки, 4 дня и в день окончания наблюдения каждое животное взвешивали.

Учет результатов: Испытание считают удовлетворительным, если:

— все животные остаются живыми в течение периода наблюдения;

— ни у одного из животных не выявлены признаки заболевания, интоксикации;

— ни у одного из животных, получивших испытуемый препарат подкожно, не развился некроз или абцесс в месте его введения;

-масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной.

Заключение:

Исследуемый препарат в дозе 1 мл/животное нетоксичен (результаты контроля приведены в приложении к протоколу).

Приложение к протоколу

Результаты контроля токсичности

         
Вид животногоНомер животного, меткаВес животного, гДоза препарата в млСпособ введенияДни наблюдения
До начала экспериментаЧерез один деньЧерез четыре дняЧерез семь дней
Морские свинкичерная2562562602691подкожно
Срок наблюдения – 7 дней. За период наблюдения все животные живы и здоровы
белая282282295320
Мыши белые беспородныеСуммарный вес (5 голов)931021101331внутрибрюшинно


Испытания на пирогенность

Испытание на пирогенность проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I (ОФС.1.2.4.0005.15).

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по     ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Испытание на пирогенность основано на измерении температуры тела у кроликов до и после инъекции. Испытуемое инъекционное средство вводили в ушную вену кролика в дозе 1 мл/животное. Перед введением раствор подогревали до 37,0±2 оС. Испытание инъекционного средства проводили на группе из трех кроликов и исходной температурой 38,5-39,5 оС. Перед опытом, с интервалом не менее 30 мин, у каждого кролика дважды измеряли температуру тела. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не превышали 0,2 оС. За исходную температуру принимали величину последнего результата измерения. Раствор испытуемого средства вводили животным сразу после второго измерения температуры. Измерения температуры после внутривенного введения испытуемого средства проводили с интервалом не более 30 мин на протяжении трех часов.

Учет результатов: Определяли максимальное изменение температуры (дельта t) тела каждого кролика по сравнению с исходным значением. В соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи Российской Федерации изменение температуры тела животного ниже исходной величины принимают за нуль и не учитывают.

При испытании на 3-х кроликах инъекционное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 1,2 оС, а индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превышает 0,5 оС.

Заключение: Исследуемый препарат в дозе 1 мл/животное непирогенен. Максимальное повышение температуры у кроликов по сравнению с исходным значением составило 0,2 оС и индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превысило 0,5 оС. Результаты контроля приведены в приложении к протоколу.

Приложение к протоколу

Результаты контроля пирогенности

              
№ животного, клеткиМасса животного,
кг
Доза, млТемпература
тела животного
Заключение
Температура тела животного до введения препаратаТемпература тела животного после введения препарата
t o Cза 30 минt o C перед введением препаратаt o C через 0,5 часаt o C через 1 часt o C через 1,5 часаt o C через2,0 часаt o C через2,5 часаt o C через 3,0 часаМаксимальное повышение ∆t o CСумма max. повышений ∆t o C
42.194139.139.339.239.239.139.239.239.20
непирогенен
52.445139.339.239.239.339.339.339.339.20.1
62.485139.139.13939.239.239.239.239.10.1



Испытание на стерильность

Испытание на стерильность проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I (ОФС.1.2.4.0003.15).

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по , ТУ 9385-059-05664012-2017 экспериментальная серия.

Испытание на стерильность проводили методом прямого посева.

Посевы инкубировали в течении 14 суток при температуре 32,5 ± 2,5оС в жидкой тиогликолевой среде и при температуре 22,5 ± 2,5оС  в среде Сабуро.

Заключение: Исследуемый препарат стерилен.

Протокол определения водородного показателя pH

Потенциометрическое определение pH проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I ОФС.1.2.1.0004.15 Ионометрия.

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по  ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Измерение проведено на измерителе комбинированном Seven (модификация Seven Easy) в комплекте с электродом, производства Mettler Toledo Inlab Micro № 3221186.

Перед испытаниями была проведена калибровка pH-метра и электрода по трем стандартам буферным растворам, которые охватывают интервал измерений pH данного препарата.

Заключение: значение pH представленного препарата составило 7,2 ед. pH.


Испытания на цитотоксичность

Испытание на цитотоксичность проведено в соответствии с ГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro».

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Линия клеток: DK-4 штамм диплоидных клеток из кожно-мышечной ткани эмбриона человека получен из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки фибробластоподобные с ядрами овальной формы. Монослойный способ культивирования. Бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы в культуре клеток не обнаружены.

Условия культивирования: Клетки выращивали в ростовой питательной среде Игла  МЕМ (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) с 10 %  сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США), 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина в CO2 инкубаторе при 37 оС. Посевная концентрация составляла (0,5-1,0)х106 клеток в 1 мл, кратность рассева 1:3, клетки пересевали каждые 3 − 4 суток. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяли 0,25 %-ный раствор трипсина (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) и 0,02 %-ный раствор версена (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) в соотношении 1:2.

Контроли. В качестве контролей использована ростовая питательная среда с 10 % сыворотки. В качестве препарата сравнения использован «Имплантат для подкожного введения NCTF 135 во флаконах объемом 5 мл» производства Filorga S.A.S. 2-4, rue de Lisbonne 75008 Paris (Франция), Регистрационный номер медицинского изделия ФСЗ 2008/02524, а также препарат «Dermaheal HSR» производства Caregen (республика Корея).

Клеточный ответ оценивали с помощью МТТ-теста. Исследование цитотоксичности препарата проводили с использованием МТТ-теста. Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 7 – 10 х103 клеток/лунка, инкубировали в течение 24 часов при 37оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили препараты в широком диапазоне концентраций  (0,7 – 90%) и совместно культивировали в течение 72 часа при стандартных условиях культивирования. Жизнеспособность клеток оценивали по включению клетками 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н- тетразолиум бромида (МТТ) (Sigma, США) и преобразования его в формазан митохондриальными дегидрогеназами. Для этого в каждую лунку добавляли МТТ-реагент в конечной концентрации 250 мкг/мл, инкубировали клетки в течение 4 часов, затем растворяли образовавшийся формазан 100 мкл ДМСО. Далее снимали значения оптической плотности субстрата в лунках с помощью на микропланшетном фотометре Multiskan FC (Thermo Scientific) при длине волны 492 нм. Процент жизнеспособных клеток вычисляли по формуле: оптическая плотность раствора опыта / оптическая плотность раствора контроля х 100 %. Статистические отличия рассчитывались с помощью критерия Манн-Уитни в программе Statistiсa 8.

 Рис.1. Влияние препаратов на жизнеспособность фибробластоподобных клеток человека после совместной инкубации в течение 72 часов.

Заключение: Экспериментально доказано, что гель для внутрикожных инъекций  «НЕОКОЛЛ+» не оказывал цитотоксическое влияние на фибробласты человека, напротив показано, что препарат стимулирует пролиферацию клеток в концентрации от 2,8 – 90 % (рис.1). Тогда как, препарат «Dermaheal HSR» (Caregen, республика Корея) значительно снижал жизнеспособность фибробластоподобных клеток человека в дозе от 11,25 – 90 % процент жизнеспособных клеток снизился до 40 %.


Оценка влияния на морфологию и пролиферацию фибробластов человека

с помощью системы для анализа клеток Cellavista

Система для анализа клеток Cellavista. Cellavista представляет собой полностью автоматизированную систему для анализа клеток, которая позволяет получать как флуоресцентные изображения клеток, так и микрофотографии в светом поле. Оптическая система прибора снабжена пятью объективами: 2x, 4x, 10x, 20x and 40x, а также CCD – камерой, которая позволяет получать 4 Мпикс изображения. С помощью Cellavista можно анализировать клетки, помещенные в культуральные планшеты 6, 24, 96-луночные, либо на предметные стекла. Области применения Cellavista: конфлюэнцию и морфологию клеток, клонирование единичных клеток, оценка экспрессии по флуоресценции белков, подсчет и характеристика клеточных ядер, оценка эффективности трансфекции, контроль качества планшетов, подсчет клеток в суспензии, изучение вирусных бляшек, изучение апоптоза, изучение слияния клеток и многие другие функции.

Для получения изображений микропланшет с клетками помещают в устройство и устанавливают настройки изображения (коэффициент усиления, интенсивность и время облучения, фокус). В зависимости от типа анализа могут быть установлены различные параметры для анализа полученных изображений: число клеток, кластеры клеток, колонии и т.д.

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Линия клеток: DK-4 штамм диплоидных клеток из кожно-мышечной ткани эмбриона человека получен из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки фибробластоподобные с ядрами овальной формы. Монослойный способ культивирования. Бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы в культуре клеток не обнаружены.

Условия культивирования: Клетки выращивали в ростовой питательной среде Игла  МЕМ (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) с 10 %  сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США), 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина в CO2 инкубаторе при 37 оС. Посевная концентрация составляла (0,5-1,0)х106 клеток в 1 мл, кратность рассева 1:3, клетки пересевали каждые 3 − 4 суток. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяли 0,25 %-ный раствор трипсина (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) и 0,02 %-ный раствор версена (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) в соотношении 1:2.

Контроли. В качестве контролей использована ростовая питательная среда с 10 % сыворотки. В качестве препарата сравнения использован «Имплантат для подкожного введения NCTF 135 во флаконах объемом 5 мл» производства Filorga S.A.S. 2-4, rue de Lisbonne 75008 Paris (Франция), Регистрационный номер медицинского изделия ФСЗ 2008/02524, а также препарат «Dermaheal HSR» производства Caregen (республика Корея).

Оценка влияния препаратов на морфологию клеток с помощью системы Cellavista. Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 7 – 10 х 103 клеток/лунка, инкубировали в течение 24 часов при 37оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили препараты в широком диапазоне концентраций  (0,7 – 90%) и совместно культивировали в течение 72 часа при стандартных условиях культивирования. После чего планшет с клетками помещали в систему Cellavista, с помощью которой получали изображения клеток в световом поле, используя объектив х20, и анализировали полученные изображения с помощью функции «Cell confluence» (конфлюэнция клеток) программного обеспечения Cellavista software.

Результат исследований: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях не оказывал влияние на морфологию фибробластов человека (рис. 2). Через 72 часа совместного культивирования клеток с препаратом «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях уровень конфлюэнции (% поверхности культуральной посуды, занятой клетками) клеточного монослоя составил 90 – 100 %, также как и в контроле. Тогда как, при добавлении в культуру клеток 22,5 – 90 % препарата сравнения «Dermaheal HSR» (Caregen, Корея) наблюдалось выраженное цитотоксическое действие на клетки, частичная или полная деструкция монослоя клеток, повреждение отдельных клеток и образование клеточного детрита. При совместном культивировании препарата NCTF 135 (Filorga, Франция) изменения морфологии клеток не наблюдалось, однако конфлюэнция клеточного монослоя при культивировании с 90 % этого препарата была снижена до 70 % по сравнению с контролем.

Заключение: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях не вызывал морфологических изменений фибробластов человека и снижение уровня конфлюэнции клеточного монослоя по сравнению с контролем.

Рис. 2. Световая микроскопия фибробластов человека совместно культивированных с препаратом «НЕОКОЛЛ+», а также с препаратами сравнения NCTF 135 (Filorga, Франция) и Dermaheal HSR (Caregen, Корея) в концентрациях: 11,25 %, 22,5 %, 45 %, 90 %. В качестве контроля использована ростовая питательная среда с 10 % сыворотки.  Изображения получены с помощью системы Cellavista (объектив х20).


Исследование влияния препаратов на апоптоз и пролиферацию клеток с помощью системы Cellavista.

Влияние препаратов на апоптоз и пролиферацию клеток оценивали путем окрашивания клеток ядерным флуоресцентным красителем Hoechst 33342 [Y. Lee and E. Shacter, J. Biol. Chem., 1999].

Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 7 – 10 х 103 клеток/лунка, инкубировали в течение 24 часов при 37оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили препараты в широком диапазоне концентраций  (0,7 – 90%) и совместно культивировали в течение 72 часа при стандартных условиях культивирования. После этого клетки окрашивали красителем Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США) в течении 30 минут при 37 oC, после чего клетки трижды отмывали фосфатно-солевым буфером. Система Cellavista была использована для автоматического получения изображений клеток минимум в 6 полях/лунку, используя объектив х20, в световом поле и флуоресцентном канале. Количество апоптотических и делящихся клеток анализировали с помощью программного обеспечения Cellavista software.

Live – живые клетки, Apoptotic – клетки в апоптозе.

 

 

Результат исследований: гель для внутрикожных инъекций  «НЕОКОЛЛ+» значительно стимулировал пролиферацию фибробластов человека в концентрации 11,25 – 90 %, при этом число апоптотических клеток по сравнению с контролем было снижено. Препарат сравнения Dermaheal HSR значительно снижал количество живых клеток в культуре в концентрации 22,5 – 90 % при этом число апоптотических клеток было значительно увеличено. Другой препарат сравнения NCTF 135 (Filorga, Франция) в концентрации 5,6 – 11,25 % стимулировал пролиферацию клеток, а в дозе 45 – 90 % снижал количество живых клеток и увеличивал число клеток в апоптозе.

Заключение: Экспериментально доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» стимулирует пролиферацию фибробластов человека, снижая при этом число апоптотических клеток.

ВЫВОДЫ

  1. В экспериментах на животных доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» в дозе 1 мл/животное нетоксичен.

  2. Исследована пирогенность препарата, гель «НЕОКОЛЛ+» в дозе 1 мл/животное непирогенен.

  3. Препарат «НЕОКОЛЛ+» стерилен.

  4. pH препарата экспериментальной серии препарата «НЕОКОЛЛ+» составляет 7,2 ед.

  5. С помощью МТТ-теста доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» не оказывал цитотоксическое влияние на фибробласты человека, напротив препарат стимулировал пролиферацию клеток в концентрации от 2,8 – 90 %.

  6. С помощью системы Cellavista установлено, что препарат «НЕОКОЛЛ+» во всех исследуемых концентрациях не вызывал морфологических изменений фибробластов человека и снижение уровня конфлюэнции клеточного монослоя по сравнению с контролем.

  7. С помощью системы Cellavista показано, что препарат стимулирует пролиферацию фибробластов человека, снижая при этом число апоптотических клеток.

 

 

 

Больше информации о семинарах и препаратах НЕОКОЛЛ+,  НЕОКОЛЛ и  ЛИФТ БИОМАТРИКС смотрите здесь